O型FMDV复合多表位在毕赤酵母中的表达与鉴定

将O型FMDV复合多表位CTB-TEpi与FMDV结构基因P1-2A(P1/2A)连入毕赤酵母表达载体pPIC9K,经SacⅠ线性化后,利用电转化法整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)基因组中。通过G418浓度梯度筛选得到高拷贝阳性转化子GS115/P1/2A-CTB-TEpi。经甲醇诱导表达后,目的蛋白在毕赤酵母中获得成功表达,并在FMDV自裂解片段2A的作用下裂解为P1/2A和CTB-TEpi 2个片段,相对分子质量分别为81 800和39 400,占上清液中可溶蛋白的比例为25%。Western blotting分析表明,表达蛋白的2部分均可被抗O型FMDV的血清所识别,而且含有CTB片段的CTB-TEpi条带可以被兔抗霍乱毒素血清识别,证明表达的蛋白具有抗原活性,为进一步研究O型FMDV复合多表位亚单位疫苗的免疫效果打下了基础。     

绵羊β-防御素在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

根据GenBank中绵羊β-防御素(SBD-1)的全长cDNA序列设计合成1对引物,PCR扩增SBD-1基因并与T载体成功连接,然后将其成熟肽编码片段亚克隆到毕赤酵母表达载体Ppic9k上,构建真核表达质粒Ppic9k-mSBD-1,将其在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,表达产物纯化后进行活性鉴定。结果表明,mSBD-1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显。     

重组毕赤酵母恒化培养研究进展

从底物流加策略、甲醇流加方法、甲醇浓度和稀释率几个方面综述重组毕赤酵母（Pichia pastoris）恒化培养。     

His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1).     

粗糙脉孢菌GH45家族内切纤维素酶基因ncGH45在毕赤酵母中表达及重组酶的性质表征

纤维素酶作为一种重要的糖苷水解酶,在生物质能源生产、饲料、造纸、洗涤和纺织领域都有着非常广泛的应用。粗糙脉孢菌来源的GH45家族内切纤维素酶基因(nc GH45)全长935 bp,包含一个53 bp的内含子(339-391),编码272个氨基酸,包括一个N-端的GH45家族催化结构域和C-端的1家族碳水化合物结合结构域。该基因在毕赤酵母中得到了分泌表达,且表达蛋白条带单一,酶活性达到20 U/m L。重组酶r Nc GH45的最适p H为4.5~5.0,最适温度为60~65℃,并且在较宽的p H范围(p H 4.0~8.0)和温度范围(30~70℃)都能维持75%以上的酶活。在37℃和50℃,p H 3.0~11.0都有着非常好的稳定性;该酶的热稳定性非常好,在70℃和80℃处理2 h还能剩余89.6%和77.7%的酶活,即使在沸水中煮10 min还能剩余10%的酶活。r Nc GH45的最适底物是地衣多糖(1 116.0 U/mg),其次是大麦葡聚糖(754.2 U/mg)和CMC-Na(254.6 U/mg),对大麦葡聚糖和CMC-Na的动力学常数Km和Vmax分别为6.26 mg/m L和997.4μmol/mg·min,19.96 mg/m L和722.1μmol/mg·min。水解产物分析结果表明,r Nc GH45对多糖的水解产物主要是纤维五糖,对寡糖的最小作用底物是纤维三糖,而对纤维二糖没有作用。对纺织品脱毛实验的结果表明,酶的添加量为10 U时,减量率为1.55%。上述结果表明成功构建了r Nc GH45高效表达工程菌株,表达的重组蛋白性质优越,有着良好的工业应用前景。     

家蚕微孢子虫蓖麻毒蛋白B链基因RBL463-4的克隆及在毕赤酵母中的表达

基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

为制备猪瘟病毒(CSFV)特异性诊断抗原,根据国内CSFV流行毒株的序列合成了其主要的保护性抗原Erns蛋白的基因序列,将合成的基因按设计的酶切位点与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-Erns.用SalI将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌.经筛选、鉴定,成功获得了表达CSFV的Erns蛋白的阳性重组酵母菌.该阳性重组酵母菌经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白.Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别CSFV抗体,且具有很好的反应原性.     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

抗甲胺磷单链抗体基因的酵母表达及性质鉴定

为了构建高效表达阳性抗甲胺磷单链抗体(scFv)基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris系统,设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,构建重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris(X-33),抗性梯度筛选转化子以获得高效表达菌株,对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果:获得了稳定高效表达菌株X-33-Pp-Met-28D4-1,该菌株优化条件下的scFv诱导表达量为25 mg/L,纯化产物对甲胺磷的抑制中浓度IC50为93.52μg/mL,抗原抗体亲合常数为2.34×10-8mol/L。因此利用Pichia pastoris表达系统可大量制备功能性抗甲胺磷单链抗体。